0 引言
大腸桿菌，學(xué)名大腸埃希氏菌，是人和動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，主要寄生在大腸內(nèi)。若此菌在水和食品中檢出，可能是由于糞便污染，表示其中可能有腸道病原菌，因此，對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)常作為重要衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一。此外，部分致病性大腸桿菌侵入人體后可引起感染，有關(guān)食品中存在大腸桿菌導(dǎo)致人員中毒的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，如2013年在云南曾暴發(fā)因冷凍肉感染大腸桿菌而導(dǎo)致人員中毒事件2016年食堂工作人員攜帶非典型致病性大腸桿菌所造成食品污染導(dǎo)致26名小學(xué)生食源性疾病暴發(fā)事件。國(guó)外也同樣出現(xiàn)了大腸桿菌危害食品安全的現(xiàn)象。1982—2002年美國(guó)曾有多例食源性大腸桿菌污染事件發(fā)生，其中有7例與乳制品相關(guān)。乳制品中大腸菌群的污染占有很大比例，在2016—2018年和2019年前三季度我國(guó)乳制品微生物項(xiàng)目監(jiān)督抽檢中，大腸菌群超標(biāo)最為嚴(yán)重，其中發(fā)酵乳占有很大的比例。大腸桿菌具有一定的耐酸性，酸奶及乳飲料被其污染可能會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，危害人類(lèi)食品安全，監(jiān)測(cè)大腸桿菌在產(chǎn)品中的檢出及變化情況至關(guān)重要。
因此，本文模擬生產(chǎn)中產(chǎn)品污染大腸桿菌的情況，向酸奶及乳飲料中接種大腸桿菌，監(jiān)控其在不同pH、儲(chǔ)藏溫度條件下，儲(chǔ)藏過(guò)程中菌含量變化及pH的變化情況，為實(shí)際生產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)品冷藏及脫冷條件下大腸桿菌的檢驗(yàn)檢測(cè)和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供理論依據(jù)和理論指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922。
1.1.2 試劑
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；氯化鈉。
1.1.3 儀器與設(shè)備
BSC1500IIA2-X生物安全柜；FE28-TRIS pH計(jì)；HVM1渦旋儀；JJ1000A電子天平；BSP-250生化培養(yǎng)箱；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
取保存于-80℃冰箱中磁珠管中的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，取1粒磁珠轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，活化三代后備用。
1.2.2 樣品制備
(1）樣品中不同濃度大腸桿菌在不同儲(chǔ)藏溫度下含量的變化
選取酸奶（250 g/瓶），乳飲料（300 mL/瓶）各16瓶，先將活化后菌液（1.2.1）用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至103 CFU/mL和105 CFU/mL兩個(gè)梯度，再將稀釋后菌液接種至酸奶、乳飲料中使其菌含量約為10 CFU/mL和103 CFU/mL。以上接種后樣品分別儲(chǔ)藏于4℃和25℃兩個(gè)溫度條件下，定期測(cè)定樣品中大腸桿菌含量變化。
(2）接種大腸桿菌驗(yàn)證在不同儲(chǔ)藏條件下含量變化
市售酸奶pH范圍一般為4.2～4.5，乳飲料為3.0～4.0，本試驗(yàn)酸奶的初始pH為4.2，乳飲料為3.6，因此，分別調(diào)節(jié)酸奶及乳飲料的pH為4.2和3.6兩個(gè)組，然后無(wú)菌操作向樣品中接種大腸桿菌至樣品中菌含量約為103 CFU/mL，分別儲(chǔ)藏于4℃和25℃條件下，測(cè)定樣品中大腸桿菌含量變化及樣品pH的變化情況。根據(jù)不同的儲(chǔ)藏條件及pH分為以下四個(gè)組。
表1 樣品的pH及儲(chǔ)藏溫度
(3）不同pH營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)大腸桿菌含量的影響
在通常情況下?tīng)I(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基溶解后pH為7.5，本次試驗(yàn)調(diào)節(jié)初始營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH分別為3.2,3.4,3.6,3.8,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8，取1 mL大腸桿菌菌液分別接種到100 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯管中，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期測(cè)定大腸桿菌含量。
1.2.3 大腸桿菌含量測(cè)定
本試驗(yàn)采用《GB 4789.3—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中第二法測(cè)定樣品中大腸桿菌含量。
1.2.4 pH測(cè)定
采用校準(zhǔn)后的pH計(jì)測(cè)定儲(chǔ)藏過(guò)程中酸奶及乳飲料及營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH。
2 結(jié)果與分析
2.1 酸奶及乳飲料中不同濃度大腸桿菌儲(chǔ)藏后變化情況
通過(guò)向酸奶及乳飲料中接種低（10 CFU/mL，高（103 CFU/mL）兩個(gè)梯度的大腸桿菌，模擬實(shí)際生產(chǎn)中產(chǎn)品低溫儲(chǔ)藏（4℃）及可能遇到的常溫脫冷（25℃）的情況，探究酸奶及乳飲料中大腸桿菌隨時(shí)間延長(zhǎng)的含量變化情況。結(jié)果如表2所示，乳飲料在不同初始接菌量和不同儲(chǔ)藏溫度條件下，儲(chǔ)藏16天后菌含量均降低至無(wú)法檢出。酸奶樣品儲(chǔ)藏在4℃仍還有大腸桿菌存活，且高梯度中剩余量高達(dá)268 CFU/mL，但在25℃條件下儲(chǔ)藏，無(wú)論是接種高梯度還是低梯度的大腸桿菌，樣品中大腸桿菌含量均降低至無(wú)法檢出（表2）。
造成以上差異的原因可能是由于溫度適宜，乳酸菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，或者乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致樣品pH降低。從表中結(jié)果表明，大腸桿菌降低至無(wú)法檢出的樣品均為低pH的樣品。因此，低pH可能對(duì)大腸桿菌的活性造成較大的影響。
2.2 不同pH對(duì)酸奶中大腸桿菌的影響
基于2.1的結(jié)果，即酸奶和乳飲料在儲(chǔ)藏過(guò)程中大腸桿菌的存活情況不同的現(xiàn)象，進(jìn)一步對(duì)其原因進(jìn)行探究。經(jīng)測(cè)定，酸奶初始pH為4.2。由圖1a中可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，pH4.2的酸奶樣品在25℃條件下儲(chǔ)藏pH不斷降低，而在4℃條件下儲(chǔ)藏pH基本保持不變。pH為3.6酸奶樣品不管是在4℃和25℃儲(chǔ)藏pH基本保持不變。
圖1b顯示出，儲(chǔ)藏過(guò)程中，A條件下的酸奶中大腸桿菌整體呈現(xiàn)相對(duì)緩慢降低趨勢(shì)，B,C,D條件下含量呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，降低速率較快。低pH酸奶（B,D）樣品中菌均在儲(chǔ)藏4天后降低至無(wú)法檢出，C條件下儲(chǔ)藏6天后降低至無(wú)法檢出。相同儲(chǔ)藏溫度條件下，pH低的酸奶中大腸桿菌含量減少的更快，表明pH對(duì)大腸桿菌的活性造成了較大的影響。當(dāng)酸奶pH為4.2時(shí)，冷藏（4℃）條件下，大腸桿菌及乳酸菌活性均受到抑制，乳酸菌在儲(chǔ)藏過(guò)程中未進(jìn)行明顯的發(fā)酵產(chǎn)酸，酸奶在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中pH基本不變，因此大腸桿菌降低速率緩慢，儲(chǔ)藏15天后仍有菌檢出，為57 CFU/g，超出發(fā)酵乳三級(jí)采樣最高安全限量值5 CFU/g，而在25℃儲(chǔ)藏的酸奶中乳酸菌在相對(duì)適宜條件下，繁殖發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致儲(chǔ)藏過(guò)程中酸奶pH明顯降低至3.8，這可能對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生了較大的影響，其降低速率明顯高于低溫儲(chǔ)藏的酸奶樣品，但在這其中乳酸菌也可能造成了一定的影響。當(dāng)酸奶pH為3.6時(shí)，不同儲(chǔ)藏溫度間降低速率相差不大，由此可見(jiàn)，pH對(duì)酸奶中大腸桿菌的影響更為明顯。
圖1 酸奶在儲(chǔ)藏過(guò)程中的大腸桿菌菌含量（a）及pH(b）的變化情況
表2 不同產(chǎn)品在不同儲(chǔ)藏溫度條件下大腸桿菌含量及pH的變化情況
2.3 不同p H對(duì)乳飲料中大腸桿菌的影響
乳飲料初始pH為3.6,A條件下儲(chǔ)藏的乳飲料pH基本不變，而25℃儲(chǔ)藏過(guò)程中pH降低，可降到3.4。與酸奶不同的是在pH 3.6的低pH下，25℃儲(chǔ)藏乳飲料的pH持續(xù)降低，這可能是由于酸奶與乳飲料中乳酸菌菌種不同造成的。乳飲料中為更耐酸性的菌種，乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致pH持續(xù)降低。（圖2b）與酸奶相同，A條件下的乳飲料中大腸桿菌含量先略有增加后降低，可能是由于大腸桿菌對(duì)低溫具有一定的抗性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，不利于其生長(zhǎng)，菌含量明顯降低，其他條件下乳飲料中的大腸桿菌含量隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)而減少，B、C、D條件下的乳飲料分別在儲(chǔ)藏10,6,4天后，大腸桿菌的量降低至無(wú)法檢出，且樣品pH分別為3.6,3.7,3.5，而A條件下的乳飲料直至儲(chǔ)藏15天后仍有菌存活，為28 CFU/mL。圖2a中可以看出，儲(chǔ)藏溫度越高，pH低的乳飲料中菌含量降低的越快。儲(chǔ)藏溫度及pH均對(duì)大腸桿菌的活性造成了一定的影響。
2.4 pH對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響驗(yàn)證
大腸桿菌對(duì)酸性具有一定的抗性，但相對(duì)更低的pH也會(huì)對(duì)大腸桿菌的活性造成影響。有文獻(xiàn)報(bào)道大腸桿菌最低培養(yǎng)溫度為7℃左右，適合生長(zhǎng)的最低pH為4左右。表中為pH不同的培養(yǎng)基中大腸桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中的變化情況。
當(dāng)pH>3.8時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖，菌含量增加，而當(dāng)pH≤3.8時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)大腸桿菌活性受到抑制，菌含量逐漸降低，由此可見(jiàn)較低的pH對(duì)大腸桿菌造成了一定的影響。乳飲料的pH相對(duì)酸奶更低，因此，對(duì)大腸桿菌活性造成了抑制，加速了大腸桿菌的失活，低溫條件下，正常乳飲料（pH 3.6）在儲(chǔ)藏6天后菌含量降低為2 CFU/mL，隨時(shí)間延長(zhǎng)，第10天降低至無(wú)法檢出，而酸奶（pH 4.2）在儲(chǔ)藏15天仍有菌檢出（圖1a，圖2a）。
3 結(jié)果與討論
產(chǎn)品中大腸菌群污染控制對(duì)于消費(fèi)者的食品安全來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，因此了解大腸桿菌污染產(chǎn)品后隨著儲(chǔ)藏時(shí)間及條件改變的變化規(guī)律具有重大意義。為了保障酸奶及乳飲料的品質(zhì)，一般低溫冷藏（4℃）保存，但當(dāng)在出廠運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)脫冷的情況，因此研究保質(zhì)期內(nèi)產(chǎn)品中感染大腸桿菌后的變化情況具有重要意義。低pH明顯加速大腸桿菌的衰亡，儲(chǔ)藏溫度及pH均對(duì)產(chǎn)品造成了一定的影響，但儲(chǔ)藏溫度對(duì)產(chǎn)品中大腸桿菌的影響可能是由于溫度升高產(chǎn)品中乳酸菌發(fā)酵，pH降低導(dǎo)致的。當(dāng)產(chǎn)品在運(yùn)輸、銷(xiāo)售等過(guò)程中發(fā)生脫冷時(shí)，通常認(rèn)為大腸桿菌可能繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣導(dǎo)致產(chǎn)品脹包，然而本試驗(yàn)過(guò)程中，產(chǎn)品中大腸桿菌并未增加，25℃儲(chǔ)藏的酸奶及乳飲料在整個(gè)儲(chǔ)藏期間均未發(fā)生脹包現(xiàn)象，相反pH降低加速大腸桿菌的滅亡。大腸桿菌在不同pH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)，再次證明了pH對(duì)大腸桿菌的影響。這對(duì)于生產(chǎn)中實(shí)際檢驗(yàn)檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。大腸菌群作為生產(chǎn)過(guò)程衛(wèi)生指示菌，對(duì)其的控制非常重要。由于pH對(duì)大腸菌群的影響，檢測(cè)成品可能并不能代表真實(shí)情況，需要及時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)檢測(cè)。因此，為了更好控制食品安全，對(duì)于酸奶類(lèi)產(chǎn)品建議在發(fā)酵前或者成品灌裝后及時(shí)檢測(cè)。
圖2 乳飲料在儲(chǔ)藏過(guò)程中的菌含量（a）及pH(b）的變化情況
表3 pH不同培養(yǎng)基中大腸桿菌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)的變化情況
